INTRODUÇÃO
A imuno-hematologia consiste em uma especialidade das análises
clínicas que estuda os antígenos presentes nos elementos
sanguíneos e anticorpos direcionados contra tais antígenos,
definindo as propriedades e reações imunológicas
entre os mesmos. A imuno-hematologia encontra-se intimamente relacionada
com a medicina transfusional, envolvendo a transfusão de
componentes sanguíneos e derivados. Através da realização
de exames laboratoriais, avaliação dos resultados
e de procedimentos adicionais ela fornece subsídios necessários
para o estudo da patogênese, diagnóstico, prevenção
e conduta em situações de imunização
(sensibilização) associada à transfusão,
gestação e transplante de órgãos (HENRY,
1999).
A pesquisa de anticorpos irregulares consiste na aplicação
da técnica indireta da antiglobulina visando a triagem
dos anticorpos direcionados aos antígenos de grupos sanguíneos,
excluindo-se o ABO. O significado clínico dos anticorpos
detectados dependerá da temperatura de reação,
potência (grau de reatividade), classe de imunoglobulina
e capacidade de ativação do sistema complemento.
Geralmente, o anticorpo clinicamente significativo é reativo
a 37° C e/ou fase de antiglobulina humana, portanto, sendo
anticorpos de classe IgG ou IgM de grande amplitude térmica
(GIRELLO, 2002).
A identificação dos anticorpos, previamente detectados
nos exames de triagem, é realizada através da testagem
de um painel de 11 hemácias reagentes contra o soro do
receptor utilizando o teste de Coombs indireto. No Brasil, a maioria
dos produtores fornecem painéis de células reagentes
com 11 células, com o objetivo de atingir um intervalo
de confiança de 99% na identificação de muitos
dos anticorpos comumente encontrados (AABB, 1999). Entretanto,
como é difícil assegurar que tenhamos no painel
3 células positivas ou negativas para cada um dos antígenos
(Girello, 2002), células adicionais podem ter que ser testadas,
e deverão ser obtidas de outros painéis ou células
selecionadas, para uma melhor determinação da possível
especificidade de certos anticorpos, particularmente aqueles dirigidos
contra antígenos de baixa ou alta freqüência.
O teste de Antiglobulina Direto baseia-se na ligação
da antiglobulina humana (presente no antisoro reagente) na fração
constante dos eventuais anticorpos previamente ligados à
membrana eritrocitária, determinando uma reação
de hemaglutinação, uma vez que os anticorpos incompletos
(ligados primariamente às hemácias) não são
capazes de determinarem reações de aglutinações,
necessitando da ligação da antiglobulina para que
ocorra a reação. Este exame é aplicado nos
seguintes casos: investigação de reações
hemolíticas pós-transfusionais de caráter
imunológico; doença hemolítica do recém-nascido;
investigação de auto-anticorpos e pesquisa de anticorpos
induzidos por drogas.
A Eluição é o processo utilizado para remover
anticorpos ligados aos eritrócitos, sendo empregado quando
um teste de antiglobulina humana direto tem resultado positivo
e o anticorpo deve ser removido para posterior identificação.
OBJETIVOS
O estudo consistiu na avaliação imuno-hematológica
e o monitoramento na identificação de aloanticorpos
e auto-anticorpos em pacientes politransfundidos com concentrados
eritrocitários, definindo o índice de imunização
bem como a freqüência dos principais aloanticorpos
e auto-anticorpos.
CASUÍSTICA, MATERIAL
E MÉTODOS
PACIENTES
Foi avaliado um grupo de 50 pacientes politransfundidos com
concentrado de hemácias, entre eles crianças e
adultos, homens e mulheres de diversas etnias, atendidos pelo
Hemonúcleo de Catanduva (Hemorede da Fundação
Faculdade Regional de Medicina de SJRP) durante o período
compreendido entre abril de 2001 e outubro de 2002.
Os pacientes apresentavam patologias distintas, porém
todos necessitando de suporte hemoterápico contínuo
e apresentando positividade na pesquisa de anticorpos irregulares
e/ou na técnica de antiglobulina direta.
As principais patologias de base foram doenças neoplásicas
hematológicas e não hematológicas, anemias
hemolíticas congênitas e adquiridas, insuficiência
renal crônica, síndrome da imunodeficiência
adquirida e pacientes necessitando de atendimento de urgência
(pronto-socorro e centro cirúrgico).
OBTENÇÃO DE
AMOSTRAS BIOLÓGICAS
As amostras utilizadas para os exames foram obtidas através
das técnicas convencionais de flebotomia sem a necessidade
de preparo prévio dos pacientes, obtendo-se soro de sangue
coletado em tubo seco, o qual foi destinado para a pesquisa
e identificação dos anticorpos; e sangue total
em tubo contendo anticoagulante (EDTA 10%), utilizado para os
exames de técnica direta de antiglobulina e eluição
ácida.
MÉTODOS
1 - PESQUISA DE ANTICORPOS
1 - IRREGULARES
Realizada através da transferência das hemácias
reagentes (ID-Diacell I+II-Diamed) e soro do paciente (de acordo
com protocolo específico) em microtubo contendo o soro
antiglobulina humana, suspenso no gel (cartão ID-Liss/Coombs-Diamed)
e posterior fase de incubação a 37ºC. Após
fase de incubação, realizar centrifugação
padronizada, leitura e interpretação dos resultados.
Os anticorpos eventualmente presentes no soro dos pacientes
se ligarão aos seus respectivos antígenos existentes
nas hemácias reagentes durante a fase de incubação.
Durante o procedimento de centrifugação a antiglobulina
humana, presente no anti-soro reagente, efetuará ligações
às frações constantes destes anticorpos,
formando um complexo, o qual permanecerá retido na matriz
do gel, não se sedimentando no fundo do microtubo após
o processo de centrifugação, evidenciando uma
reação positiva que poderá apresentar diferentes
intensidades, de acordo com escala de aglutinação
padronizada, variando de 1+ a 4+.
2 - IDENTIFICAÇÃO DOS
2 - ANTICORPOS IRREGULARES
Realização da técnica indireta de antiglobulina
humana, conforme descrito anteriormente na pesquisa de anticorpos
irregulares, utilizando-se painel de hemácias de 11 células
(ID-Diapanel-Diamed). Posteriormente, os resultados são
comparados com o padrão fenotípico constante do
antigrama que acompanha os eritrócitos reagentes, para
que se encontre uma combinação de resultados que
determine a possível especificidade do(s) anticorpo(s).
3 - TESTE DA ANTIGLOBULINA
3 - DIRETA OU COOMBS DIRETO
O método empregado consiste na transferência da
suspensão de hemácias do paciente (de acordo com
protocolo específico) para a matriz da reação
(cartão ID-Liss/Coombs-Diamed), seguida de procedimento
de centrifugação padronizado.
A antiglobulina efetuará ligação com os
anticorpos incompletos opsonizantes dos eritrócitos,
formando complexos os quais permanecem retidos na matriz do
gel após o procedimento de centrifugação,
caracterizando uma reação positiva que apresentará
diferentes intensidades, seguindo escala padronizada, de intensidades
variando de 1+ a 4+.
4 - ELUIÇÃO
A eluição de eritrócitos pode ser realizada
através de vários métodos que alteram ou
revertem as forças de atração que mantêm
ligados o antígeno e o anticorpo, como a utilização
de solventes orgânicos (éter ou clorofórmio),
de soluções que alteram o pH (glicina ácida),
e os que promovem hemólise por alteração
da temperatura (congelamento ou aquecimento). O método
utilizado foi o de eluição ácida.
De acordo com as instruções do fabricante (Elu-Kit/Gama),
o teste deve ser realizado após a lavagem das hemácias,
previamente sensibilizadas, com solução salina
fisiológica, seguida de ciclos de lavagem com solução
de trabalho (azida sódica 0,1%), reduzindo para um mínimo
a quantidade de anticorpos dissociados das hemácias durante
esta fase. Segue-se a adição da solução
de eluição (tampão de glicina com pH baixo)
às hemácias previamente lavadas e centrifugação,
obtendo-se o eluato ácido no sobrenadante, o qual terá
seu pH ajustado à faixa recomendada ao teste (6.4 a 7.6),
através da adição da solução
tampão (hidroximetil-aminometano, contendo albumina bovina
e ázida sódica 0,1%), orientando-se por um indicador
de pH de cor azul.
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Finalmente, o eluato é testado
através do teste indireto de antiglobulina (ID-Diacell
I+II-Diamed e cartão ID-Liss/Coombs), visando a identificação
dos anticorpos previamente ligados à membrana das hemácias.
Um controle negativo também é realizado, testando-se
as hemácias reagentes com o sobrenadante obtido do último
ciclo de lavagem das hemácias dos pacientes.
Interpretação:
Positivo: reação positiva para as hemácias
reagentes. Segue-se comparação dos resultados com
o padrão fenotípico constante no antigrama das hemácias
reagentes (ID-Diapanel-Diamed) para possível determinação
da(s) especificidade(s) do(s) anticorpo(s).
Negativo: reação negativa para as hemácias
reagentes .
Obs.: quando o eluato testado resultar negativo para todas as
hemácias reagentes (e mediante a prévia negatividade
em testes utilizando-se soros monoespecíficos anticomplemento)
sugere-se a possibilidade de eventuais anticorpos induzidos por
medicamentos. Nesse estudo não foram realizados testes
com drogas específicas para a confirmação
da suspeita, apenas foi sugerida a presença de auto-anticorpos
induzidos por drogas.
RESULTADOS
Apresentamos uma avaliação de 50 pacientes portadores
de diferentes patologias, todos necessitando de suporte hemoterápico
contínuo, previamente politransfundidos com concentrado
de hemácias. Estes pacientes apresentam positividade
na pesquisa de anticorpos irregulares (técnica indireta
da antiglobulina humana pelo método de gel teste) e/ou
na técnica da antiglobulina humana direta (Coombs direto
pelo método de gel teste).
Posteriormente, foi efetuada a identificação dos
anticorpos, inicialmente detectados no soro, utilizando-se um
painel de hemácias reagentes pela metodologia do gel
teste e foram obtidos os seguintes resultados: dos 50 pacientes
avaliados, 31 (62%) apresentavam aloanticorpos, dos quais foram
identificados 11 (22%) anti-D, 6 (12%) anti-K, 5 (10%) IgG indeterminada,
4 (8%) anti-Leª, 2 (4%) anti-Jkª, 1 (2%) anti-E, 1
(2%) anti-Leú, 1 (2%) anti-Fyª; 19 (38%) apresentavam
auto-anticorpos e destes 13 (26%) auto-IgG indeterminada e 6
(12%) sugestivo de auto-anticorpo induzido por drogas
Tabela 1. Avaliação das
especificidades dos anticorpos
detectados no Hemonúcleo de
Catanduva, durante o período
de Abril de 2001 a Outubro de 2002
DISCUSSÃO
Através dos resultados obtidos foi possível a
avaliação de alguns aspectos de interesse na abordagem
de pacientes imunizados e que necessitavam de repetidas transfusões
com concentrados de hemácias.
Os anticorpos correspondentes aos antígenos do sistema
Rh apresentaram maior freqüência (24% dos aloanticorpos
detectados, sendo 11 anti-D e 1 anti-E). A alta incidência
de anti-D deve-se ao fato da alta imunogenicidade do antígeno
D, existindo a possibilidade de imunização em
80% para cada 10mL de concentrado de hemácias transfundidos
(Melo, 1996). Alguns autores citam que apenas 1 mL já
é capaz de induzir a aloimunização (ISSIT,
1999). Estes anticorpos reagem otimamente a 37° C e fase
de antiglobulina humana (Girello, 2002), ocasionando reações
hemolíticas tardias, e às vezes severas.
Em 12% dos casos o anticorpo detectado foi o anti-K (06 anti-K),
os quais são reativos a 37° C e fase de antiglobulina
humana, podendo ocasionar reações hemolíticas
transfusionais (Henry, 1999); em 4% dos casos anti-Jkª
(02 anti-Jkª), sendo os antígenos deste sistema
de moderada imunogenicidade e os anticorpos envolvidos em severas
reações hemolíticas imediatas e tardias
em politransfundidos, pois podem ativar complemento (Daniels,
1988); em 2% dos casos anti-Fyª (01 anti-Fyª), anticorpos
de classe IgG, fixadores de complemento, podendo causar reações
transfusionais agudas e tardias (Girello, 2002).
A disponibilidade prévia de concentrados de hemácias
fenotipados para antígenos dos sistemas Rh, Kell, Duffy
e Kidd é importante para o atendimento dos pacientes
politransfundidos, uma vez que os mesmos apresentam maior possibilidade
de desenvolverem episódios de imunizações,
estimada em 9% por unidade de concentrado de hemácias
transfundida (Issit, 1999) e mediante a detecção
de anticorpos irregulares, devem receber unidades de concentrados
de hemácias antígenos negativas para os anticorpos
correspondentes (Girello, 2002).
Para o atendimento cirúrgico destes pacientes imunizados,
a amostra de sangue para a realização dos exames
pré-transfusionais deve ser colhida antes da necessidade
de transfusão, permitindo tempo necessário para
seleção de unidades de concentrados de hemácias
antígenos negativas correspondentes aos anticorpos detectados
(Triulzi, 2002).
O elevado índice de auto-anticorpos (19, correspondendo
a 38% do total de anticorpos detectados) promove interferências
nos exames pré-transfusionais, dificultando a caracterização
dos principais antígenos da membrana eritrocitária,
sendo necessário nestas situações o uso
de técnicas adicionais (cloroquina e/ou bloqueio) para
a dissociação de auto-anticorpos IgG (Perdomo,
2003).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O monitoramento imuno-hematológico, através da
triagem e identificação de aloanticorpos e auto-anticorpos
antieritrocitários, em pacientes que necessitam de repetidas
transfusões com concentrado de hemácias deve ser
rigoroso, fazendo com que o hemocomponente possa ser adequadamente
empregado para fins terapêuticos, evitando reações
transfusionais inesperadas e atendendo a finalidade do estabelecimento
da homeostase. 
Leonardo Guizilini Plazas Ruiz
Biomédico, especialista em Patologia Clínica-ABBM
e Análises
Clínicas-Famerp. Instituição: FUNFARME
(Fundação Faculdade Regional de Medicina de São
José do Rio
Preto Hospital de Base)
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por Métodos Laboratoriais. 19ª ed., São Paulo:
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GIRELLO, A.L. Fundamentos da imuno-hematologia eritrocitária.
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TRIULZI, D.J. Terapêutica Transfusional-manual para médicos.
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