Efeitos da insulina sobre a proliferação e a maturação condrocítica in vitro

Elenilde M. dos S. Torres
(CRBM 7850)

Introdução

A identificação da insulina e receptores da insulina em embriões de galinha com 48h após a fertilização demonstra que, em concentrações fisiológicas, a insulina pode agir como um mitógeno para alguns tipos celulares fetais (De Pablo et al., 1982; Bassas et al., 1985). Em baixas concentrações, a insulina tem sido mostrada em elevar parâmetros do crescimento, como no metabolismo e na diferenciação muscular em embriões de galinha com 4 dias (Girbau et al., 1987).
A ossificação endocondral é um processo visto no desenvolvimento esquelético embrionário, no crescimento esquelético pós-natal e na consolidação de fraturas. Fatores de crescimento, hormônios e citocinas têm sido demonstrados como diretamente

envolvidos em sua regulação (Trippel, 1994). Uma vez que a insulina disponível é essencial para o crescimento fetal ótimo, seu efeito foi examinado na maturação da cartilagem in vitro utilizando-se a cultura de micromassa em alta densidade de células mesenquimais originárias de brotos de membros de embriões de galinha.

Objetivos

Examinar os efeitos da insulina na maturação da cartilagem in vitro.

Material e Métodos

Os brotos dos membros foram removidos de embriões de galinha com

4 dias e enzimaticamente dissociados em colagenase e tripsina. A densidade celular foi ajustada para 25-30x106 células/ml. As células foram plaqueadas como micromassa de 10ml e após aderirem foram alimentadas com DMEM-F12, suplementado com soro fetal bovino (SFB) em dois grupos, a saber: 1% SFB (controle) e 1% SFB + 60ng/ml insulina. A partir do dia 2, o meio foi suplementado com 2.5mM de ß-glicerofosfato e 25µg/ml de ascorbato. As células foram coletadas nos pontos 7, 14 e 21 dias para subseqüente análises dos estados de crescimento e diferenciação. A hipertrofia celular foi avaliada pela atividade da fosfatase alcalina (ALP), enquanto a morfologia celular foi avaliada pela microscopia eletrônica de transmissão. A proliferação celular foi avaliada pela incorporação de timidina-H3 e pela

Figura 1 - Pelo dia 14 a ALP é significativamente maior (p<0.05) nas culturas controle. Os valores representam a média, n=6.	Figura 2 – M.E. de culturas tratadas com insulina (à esquerda, 21 dias, 6600X) e 1% SFB (à direita, 14 dias, 4500X). Observar as numerosas vesículas intracitoplasmáticas (asteriscos), relacionadas com organização de feixes de fibrilas (seta) na cultura controle.
Figura 3 - Gráfico comparativo da síntese de DNA nas culturas tratadas com insulina e 1% SFB. As culturas apresentam um pico proliferativo no dia 14 (p<0.05). Os valores representam as médias, n=6.	Figura 4 – Nas culturas iniciais (dia 7, à esquerda) o padrão de imunomarcação com o PCNA foi semelhante nos dois grupos. Apesar do tempo, a insulina mantém a taxa de proliferação celular (dia 21, à direita), enquanto que a cultura controle deixa de expressar a positividade (dia 21, centro). Contra-corante: hematoxilina de Mayer. Aumento:40X.

imunorreatividade para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA). Os resultados foram analisados com o teste-t pareado de Student para análise paramétrica.

Resultados
Em todos os pontos analisados, a atividade da ALP estava diminuída nas culturas tratadas com insulina (fig. 1). A análise ultra estrutural (fig. 2) mostrou que os condrócitos tratados com insulina exibiram atividade secretória diminuída, demonstrada pelas poucas vesículas intracitoplasmáticas e pequena quantidade de fibrilas. Nas culturas controle, o condrócito hipertrófico está rodeado pela matriz com feixes de fibrilas (seta) mostrando periodicidade de colágeno e grande quantidades de vesículas intracelulares (asteriscos). A captação de timidina-H3 (fig. 3) mostrou um pico de proliferação no dia 14 em todas as culturas. Nas culturas tratadas com insulina, a imunorreatividade para o PCNA (fig. 4) foi amplamente detectada e persistiu até o dia 21.

Comentários acerca dos resultados

• A cultura de micromassa possui a conveniência de repetidamente seguir um modelo esperado de crescimento e diferenciação e alcançar a formação de cartilagem como um tecido tri-dimensional uniforme.

• As células submetidas ao tratamento com insulina exibiram significativamente menor atividade da ALP e também diminuída síntese de colágeno, conforme observado pela microscopia eletrônica de transmissão.

• Os tecidos fetais são sensíveis aos efeitos tróficos da insulina e mantém a

viabilidade do condrócito na ausência de hipertrofia celular, observações que estão de acordo com a literatura (Hill & De Sousa, 1990; Ballock & Reddi,1994).

• Com o tempo elevado da cultura, as células tratadas com 1% SFB, apresentaram diminuição significativa no número de células coradas positivamente para o PCNA. Enquanto nas culturas tratadas com insulina, a proliferação celular foi mantida por longo tempo.

Conclusão
Nossos achados sugerem fortemente que as células cartilaginosas sob a influência da insulina sustentam seu potencial proliferativo e não se tornam condrócitos hipertróficos típicos, sugerindo que a insulina regula a maturação e a hipertrofia destas células através de um possível efeito anti-apoptótico, observações que estão de acordo com a literatura (Lida et al., 2002).

A autora é biomédica pela Universidade
do Rio de Janeiro (UNI-RIO) e Doutora
em Patologia pela Universidade Federal Fluminense (UFF).
Instituição: Universidade Federal Fluminense - Depart. de Patologia
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E-mail: elenildetorres@yahoo.com.br

Referências Bibliográficas

De Pablo, F; Roth, J; Hernandez, E & Pruss, RM (1982). Insulin is present in chick eggs and early chick embryos. Endocrinology 111: 1909-1911.

Bassas, L; De Pablo, F; Lesniak, MA & Roth, J (1985). Ontogeny of receptors for insulin-like growth factor over insulin receptors in brain. Endocrinology 117: 2321-2329.

Girbau, M; Gomez, JA; Lesniak, MA & De Pablo, F (1987). Insulin and insulin-like growth factor I both stimulate metabolism, growth and differentiation in the post neurula chick embryo. Endocrinology 121: 1477-1483.

Trippel, SB (1994). Biological regulation of bone growth. In: Bone Formation and Repair. Trippel, SB; Wroblew, J & Doctrow, SR eds., AAOS, Rosemont, IL, pp. 39-60.

Hill, DJ & De Sousa, D (1990). Insulin is mitogen for isolated epiphyseal growth plate chondrocytes from the fetal lamb. Endocrinology 126: 2661-2670.

Ballock, RT & Reddi, AH (1994). Morphogenesis of columnar cartilage from isolated condrocytes in chemically defined medium. The Journal of Cell Biology 126: 1311-1318.

Lida, KT; Suzuki, H; Sone, H; Shimano, H; Toyoshima, H; Yatoh, S; Asano, T; Okuda, Y & Yamada, N (2002). Insulin inhibits apoptosis of macrophage cell line, THP-1 cells, via phospha-tidylinositol-3-kinase dependent pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol 22(3): 380-386.